LA MELITINA MODULA LA FUNCIÓN DE LOS QUERATINOCITOS A TRAVÉS DE LA ACTIVACIÓN DE ADAM DEPENDIENTE DEL RECEPTOR P2

Anselm Sommer , Anja Fries , Isabell Cornelsen ,Nancy Speck , Friedrich Koch-Nolte ,  Gerald Gimpl , Jörg Andrä ,  Sucharit Bhakdi ,  yKarina Reiss 

Introducción

El veneno de abeja producido por la abeja melífera ( Apis mellifera ) contiene una gran cantidad de péptidos bioactivos que incluyen melitina, apamina, adolapin y péptido de desgranulación de mastocitos. Melitina es el componente más abundante, constituyendo el 50% del veneno de abeja entero . Este péptido anfipático de 26 residuos contiene un tramo hidrofóbico de 19 aminoácidos seguido de un grupo de 4 residuos cargados positivamente en el extremo C terminal. Melitina es capaz de intercalarse en las membranas celulares, causando cambios en las propiedades biofísicas de la membrana. Pertenece a la familia de péptidos antimicrobianos (AMP) que se han convertido en el tema de una creciente discusión como medicamentos prometedores contra el cáncer y sustitutos de los antibióticos convencionales . La melitina in vitro puede destruir selectivamente varias células cancerosas, incluidas las células renales, pulmonares, mamarias y de la vejiga. Su posible uso como agente para tratar el carcinoma hepatocelular, el cáncer de mama y el cáncer de próstata se ha probado en modelos animales, con resultado positivo .

Además, se ha descrito que la melitina ejerce efectos antiinflamatorios, antirreumáticos, antiartríticos y analgésicos, pero el modo de acción aún se desconoce . Además de la interacción de la membrana biofísica, la melitina podría influir directamente en la función celular activando la señalización aguas abajo. Se discute como un potente activador de fosfolipasa A 2 (PLA 2 ) por lo tanto también la promoción de la síntesis de ácido araquidónico . PLA 2 efectos citotóxicos dependientes y la activación de la caspasa-3 se reportan para contribuir a la citotoxicidad anti-cáncer . También se ha sugerido que la melitina reduce las respuestas inflamatorias al inhibir la actividad de unión a ADN de NF-κB, pero este concepto sigue siendo controvertido.

Las metaloproteasas desempeñan un papel importante en las enfermedades inflamatorias y la progresión del cáncer. Se ha propuesto que la melitina podría contribuir a los efectos anti-reumatoides al inhibir la producción de la metaloproteasa de la matriz (MMP) -3. En otro estudio, la expresión de MMP-9 en células MCF-7 fue abolida por el tratamiento con melitina. Además de las MMP, las metaloproteasas disintegrinas (ADAM) desempeñan un papel importante en la salud y la enfermedad. Controlan diversas funciones celulares mediante la liberación de moléculas transmembrana de la superficie celular. ADAM10 y ADAM17 son los miembros mejor caracterizados de esta familia. ADAM10 está críticamente involucrado en la señalización del receptor Notch y la actividad de ADAM17 es esencial para la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La eliminación de ambos genes conduce a la muerte embrionaria en modelos de ratones knock-out. Se han identificado varios sustratos para ambas proteasas. ADAM10 es la principal proteasa implicada en la escisión de moléculas de adhesión celular, como neuronal (N) -cadherina, epitelial (E) -cadherina  o endotelial vascular (VE) -cadherina, pero también libera los ligandos de EGFR betacelulina y EGF , ADAM17, también conocida como TACE (enzima convertidora de TNF-α), se identificó como la enzima que libera TNF-α soluble a partir de su forma precursora transmembrana. Debido a la liberación de esta citocina proinflamatoria y otras moléculas de la superficie celular que modulan la inflamación, ADAM17 se está discutiendo como un posible objetivo farmacológico para varias patologías inflamatorias.

Hasta ahora, se ha identificado una gran cantidad de sustratos ADAM17. Entre otras cosas, la proteasa controla la función de las moléculas de adhesión celular, como la L-selectina en granulocitos de neutrófilos  y la liberación de los ligandos de EGFR anfiregulina, epirregulina, TGF-α o EGF de unión a heparina (HB-EGF) ,ADAM10 así como ADAM17 parecen promover la progresión del cáncer mediante la activación y liberación de EGFR de las moléculas de adhesión celular.

Recientemente, demostramos que las alteraciones biofísicas de las propiedades de la membrana celular modulan la división del sustrato mediada por ADAM10 y ADAM17 . La aplicación de ácidos grasos insaturados libres indujo el desprendimiento mediado por ADAM aumentando la fluidez de la membrana celular y aumentando la movilidad de la enzima y el sustrato en la membrana. A partir de estos hallazgos, surgió la sospecha de que otros agentes activos de membrana, como la melitina, también podrían aumentar la función de los ADAM.

En esta comunicación, se informa que melitina de hecho provoca una rápida división del sustrato por ADAM en diversos tipos de células. Encontramos, sin embargo, que el aumento en el desprendimiento mediado por ADAM no se debió a cambios en la fluidez de la membrana. En cambio, se presenta evidencia de que la exposición de las células a concentraciones subletales de melitina da como resultado la activación del receptor P2. Esto, a su vez, es responsable del aumento de la actividad de ADAM y de la transactivación de EGFR corriente abajo en los queratinocitos HaCaT.

DISCUSIÓN

Los efectos de la melitina en las células son notablemente diversos y los resultados funcionales son esencialmente impredecibles. Los informes sobre su acción antiinflamatoria y supresora del crecimiento se comparan con las observaciones en sentido contrario. Cómo el péptido anfipático provoca estas innumerables reacciones sigue siendo bastante enigmático. Se desconoce la existencia de un receptor celular. El dominio catiónico media la unión, que es seguido por la inserción en la membrana de la secuencia hidrofóbica cuya longitud es suficiente para abarcar solo la mitad de la bicapa lipídica. En analogía con las toxinas formadoras de poros, una posibilidad es que los poros transmembranales estén formados por oligómeros de melitina. Aunque se han demostrado aumentos en la permeabilidad de la membrana para iones y la lisis celular se produce cuando se alcanzan concentraciones críticas, no se dispone de datos sobre la composición y la estructura del poro putativo.

Este estudio agrega otra faceta al tema complejo. Divulgamos que las concentraciones subcitotoxicas de melitina causan up-regulation rápido en la función de ADAMs, las proteinasas verticales centrales de células nucleadas. Los roles cumplidos por los ADAM individuales son variados, su patrón de expresión tisular diverso y las vías de señalización que conducen a su activación heterogénea.

Elegimos centrar nuestra investigación en los efectos de la melitina en ADAM10 y ADAM17, dos miembros principales de la familia de proteinasas ADAM. Nuestros resultados indican que el tratamiento con melitina conduce a la activación de ambas proteasas. Análisis adicionales revelarán si el agente representa realmente un activador de ADAM de amplio espectro como se puede anticipar en esta etapa, y que estaría de acuerdo muy satisfactoriamente con su propensión a evocar una amplia gama de efectos biológicos.

ADAM10 es el sheddase principal de cadherins clásicos. Investigamos el desprendimiento de N-cadherina en fibroblastos murinos, VE-cadherina en células endoteliales humanas y E-cadherina en queratinocitos humanos HaCaT. Melitina estimuló rápidamente la división de cada sustrato. La escisión de VE-cadherina aumenta la permeabilidad endotelial. La escisión de E-cadherina probablemente provoca pérdida de contactos epiteliales entre células y puede contribuir a la génesis de la dermatitis eccematosa. Por lo tanto, surge una explicación retrospectivamente para el reciente descubrimiento de que la melitina aumenta la permeabilidad de las monocapas de células epiteliales de CaCo-2. ADAM17 escinde una gran cantidad de sustratos que incluyen citoquinas ( por ejemplo, TNF-α) y sus receptores ( p . Ej.IL6R), TGF-α y otros ligandos de EGFR, y L-selectina. Investigamos si la melitina induciría el desprendimiento de l- selectina en los granulocitos neutrófilos y el TGF-α en los queratinocitos HaCaT. Los resultados afirmativos obtenidos en ambos casos corroboran la afirmación de que la melitina realmente puede verse como un activador de ADAM.

El TGF-α puede activar la ruta de señalización de EGFR para inducir la proliferación celular y la migración. Dado que todos los ligandos de EGFR se liberan a través de la proteolisis, es bastante probable que el desprendimiento de ligandos adicionales contribuya a la activación de EGFR. En cualquier caso, las consecuencias funcionales tendrían que seguir. La cuestión de si el crecimiento celular se promoverá en nuestros experimentos fue de particular interés ya que la melitina se está considerando como un agente antitumoral. De hecho, se descubrió que las concentraciones subtóxicas inducen la fosforilación de ERK1 / 2. Este proceso fue metaloproteasa y dependiente de EGFR y estimuló vigorosamente la proliferación y la migración de los queratinocitos humanos HaCaT. Se requerirán análisis detallados usando inhibidores específicos o experimentos con ARNsi para diferenciar la contribución de ADAM10, ADAM17 o incluso metaloproteasas adicionales a estos procesos.

Sin embargo, estas características de promoción de la proliferación están en línea y proporcionan una explicación para la proliferación de células gastrointestinales inducida por melitina. Con respecto a la utilidad de la melitina como agente anticancerígeno, nuestros resultados cuestionan estos enfoques.

La vía que conduce a la activación de ADAM por la melitina está bajo investigación y ha dado lugar a una serie de hallazgos que son de interés. Las propiedades físicas de las membranas pueden participar en el control de la función ADAM al influir en la velocidad del movimiento molecular en la bicapa lipídica. La mejora de la fluidez mediante ácidos grasos libres insaturados acelera la escisión de los sustratos anclados a la membrana. La cinética rápida de la escisión del sustrato provocada por la melitina era una reminiscencia de los observados anteriormente para ser invocados por los ácidos grasos libres. Por lo tanto, examinamos el efecto de la melitina sobre la fluidez de la membrana, pero no pudimos observar efectos en los queratinocitos HaCaT.

Se sabe que Melitina provoca aflujo de Ca 2+ , que a su vez sería un candidato principal para desencadenar la actividad de ADAM. Los aumentos dependientes de la dosis de las concentraciones de Ca 2+ citosólico se detectaron con la exposición a la melitina. Sorprendentemente, sin embargo, la regulación positiva de ADAM por la melitina no mostró ningún requerimiento de Ca2 + y se observó en presencia de EGTA y en células cargadas con quelante de calcio intracelular BAPTA-AM. En el curso de estas investigaciones, también empleamos inhibidores convencionales de vías de señalización intracelular, pero no pudimos identificar ninguna sustancia que inhibiera eficazmente la activación de ADAM mediada por melitina (datos no mostrados).

El vínculo entre melitina y ADAM surgió cuando la atención se centró en una posible participación de los receptores purinérgicos. Algunos estudios han demostrado que, entre sus muchas funciones, estos receptores también desempeñan un papel en la regulación de la actividad de ADAM. La segmentación dependiente de ADAM de L-selectina de células B leucémicas humanas es inducible por ATP extracelular, y en ratones, el desprendimiento de esta molécula de adhesión depende de P2X7R. El mismo receptor controla el desprendimiento de CD23 y CD27, dos importantes mediadores del sistema inmune. En esos estudios, la activación de ADAM fue provocada por la aplicación de ATP en concentraciones suprafisiológicas. Aquí, proponemos que la activación del receptor purinérgico a través de un ataque de membrana por un agente extrínseco puede conducir a la regulación positiva de la función de ADAM en la célula que responde. La conclusión se deriva de dos líneas de evidencia. Primero, la activación de ADAM mediada por melitina fue suprimida por PPADS, Evans Blue y suramina, tres inhibidores comúnmente empleados de receptores purinérgicos. En segundo lugar, la transfección de P2X7 en células HEK293 aumentó la capacidad de activación de ERK de la melitina, que fue derogada de nuevo en presencia de apirasa, lo que indica claramente que la liberación de ATP representa un paso crítico para los mecanismos de transducción aguas abajo. Dada la complejidad y la redundancia de la gran familia de receptores, no se realizaron intentos aquí para identificar a otros miembros que podrían estar involucrados en la activación de ADAM. Como en estudios previos , nuestro informe se limita a la descripción del fenómeno. La elucidación de los enlaces moleculares entre los receptores purinérgicos y los ADAM sigue siendo un desafío para el futuro.

Según nuestros datos, la activación del receptor P2 inducido por melitina parece implicar ATP. Sin embargo, no está claro cómo se libera ATP y cómo se deben acumular suficientes concentraciones de ATP para activar los receptores. Múltiples mecanismos median la liberación de ATP intracelular en respuesta a diversos estímulos, que incluyen estimulación mecánica, estiramiento, cambio de osmolaridad, estrés oxidativo y productos microbianos. Los ensayos MTT indican que ya se produce la salida de ATP de las células a concentraciones de melitina no tóxicas. Por lo tanto, suponemos que este proceso representa una respuesta celular fisiológica. El péptido antimicrobiano derivado de catelicidina humana LL-37 se ha notificado de manera similar que induce la liberación transitoria de ATP en ausencia de citotoxicidad celular manifiesta.

A pesar de que la interacción de la membrana de melitina es bastante probable que induzca directamente la liberación de ATP, mecanismos adicionales podrían estar implicados, como la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). La activación del receptor P2X7 conduce a la formación de poros Pannexin-1 a través de la cual podría producirse la liberación de ATP, de modo que puede crearse además un bucle de activación autoamplificador.

Sin embargo, las concentraciones de melitina empleadas incurrieron en una pequeña depleción de ATP celular, y solo las concentraciones nanomolares fueron medibles en los sobrenadantes. Aunque las concentraciones locales de ATP en la superficie celular pueden ser considerablemente más altas, el receptor P2 y la activación de ADAM también podrían verse afectados por eventos más complejos. Esto estaría de acuerdo con el hallazgo de que la hexoquinasa ATPasa redujo pero no derogó por completo los efectos de la melitina. Se ha sugerido que la melitina interactúa con las proteínas de membrana en la superficie celular, y también se podría especular que la unión directa de la melitina a los receptores P2 puede ocurrir para afectar su activación.

Tal interacción directa con los receptores P2 se ha propuesto recientemente para el péptido antimicrobiano LL-37, y los informes sobre las propiedades de activación de P2R y EGFR de este péptido son de particular interés aquí. Existe evidencia de que el péptido induce la liberación de IL-1β en monocitos cebados con lipopolisacáridos mediante la activación de P2X7. Además, el mismo receptor parece mediar en el efecto mitogénico del péptido sobre las células epiteliales. Este último hallazgo está de acuerdo con estudios anteriores en los que se había demostrado que el ATP estimulaba la proliferación celular, muy probablemente debido a la activación de ADAM.

En resumen, este estudio ha revelado que la activación de ADAM es un evento principal descendente que ocurre después del ataque de membrana por melitina ( Fig.  ). Dependiendo del objetivo de la célula, es probable que se produzcan consecuencias funcionales muy diversas que difícilmente puedan predecirse o controlarse. Esto debería ser de interés, en particular, para los investigadores que participan en el desarrollo de la melitina como agente terapéutico.

FIGURA 

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es zbc0301215530006.jpg

Representación esquemática de efectos estimulados por melitina. La liberación de ATP inducida por Melitina conduce a la activación de los receptores P2X y P2Y, que desencadenan varias vías de señalización. Si y cómo estas cascadas de señalización activan ADAM10 y ADAM17 sigue siendo nebuloso. La activación de ADAM10 y ADAM17 da como resultado el desprendimiento de E-cadherina (E-cad) y la liberación de ligandos de EGFR. El desprendimiento de E-cadherina disminuye la adhesión célula-célula e induce la migración celular. La fosforilación de EGFR desencadena cascadas de señalización aguas abajo que conducen a una mayor migración y proliferación de queratinocitos HaCaT.

 

Las abreviaturas utilizadas son:

AMPERIO

péptidos antimicrobianos

PPADS

piridoxalfosfato-6-azofenil-2 ‘, 4’, – ácido disulfónico

PLA

fosfolipasa A

MMP

metaloproteasa de matriz

ADÁN

una desintegrina como metaloproteasa

VE

vascular-endotelial

MTT

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyltetrazolium-bromide

CTF

Fragmento C-terminal

MEF

fibroblasto embrionario murino.