EFECTOS DEL VENENO DE ABEJA EN LA TOXICIDAD INDUCIDA POR EL GLUTAMATO EN LAS CÉLULAS NEURONALES Y GLIALES

Sang Min Lee , Eun Jin Yang ,  Sun-Mi Choi , Seon Kim Hwy , Myung Gi Baek , y Jing Jiang Hua

Abstracto

El veneno de abeja (BV), que se extrae de las abejas melíferas, se usa en la terapia médica tradicional coreana. Varios grupos han demostrado los efectos antiinflamatorios del BV en la osteoartritis tanto in vivo como in vitro. El glutamato es el neurotransmisor excitador predominante en el sistema nervioso central (SNC). Se han informado cambios en la liberación y captación de glutamato debido a alteraciones en la actividad de los transportadores de glutamato en muchas enfermedades neurodegenerativas, que incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica. Para evaluar si el BV puede prevenir la neurotoxicidad mediada por glutamato, examinamos la viabilidad celular y la transducción de señales en células neuronales y microgliales tratadas con glutamato en presencia y ausencia de BV. Inducimos toxicidad glutamatérgica en células neuronales y microgliales y descubrimos que el BV protege contra la muerte celular. Además, el BV inhibió significativamente la toxicidad celular del glutamato, y el pretratamiento con BV alteró la activación de MAP quinasa (p. Ej., JNK, ERK y p38) después de la exposición al glutamato.

 Introducción

El glutamato es conocido como el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central (SNC), donde desempeña un papel importante en las funciones cerebrales, incluidas la memoria, la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la cognición. La excitotoxicidad es causada por la activación excesiva y desregulada de los receptores de glutamato. La sobreestimulación de los receptores NMDA por el glutamato puede ser la base de la degeneración neuronal anormal observada después de la hipoxia, la isquemia, la hipoglucemia y las convulsiones.

Se sabe que la neurotoxicidad del glutamato está asociada con numerosos trastornos neurodegenerativos, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), y se considera un factor clave en la patogénesis de la enfermedad. Algunos estudios han demostrado que el amiloide β proteína (A β ) inhibe la captación de glutamato y conduce a un aumento en los niveles extracelulares de glutamato . También se ha informado de que A β potencia el glutamato inducido por excitotoxicidad , lo que sugiere que el neurotransmisor podría mediar en la citotoxicidad inducida por A \ beta . In vitro , el glutamato induce diferentes tipos de muerte celular, incluida la apoptosis y la necrosis. Recientemente, la microglia se ha relacionado con el metabolismo del glutamato. Se ha demostrado que la microglia activada de ratones o macacos expresa los genes excitadores transportadores de aminoácidos EAAT-1 y -2, lo que sugiere que, al igual que los astrocitos, la microglía absorbe el glutamato y lo metaboliza a glutamina. Gras y sus colegas han sugerido que la eliminación del glutamato extracelular y la síntesis de glutamina contribuyen a las propiedades neuroprotectoras de la microglía en individuos infectados por VIH .

De hecho, la muerte de la neurona motora puede estar mediada por numerosos factores tóxicos que se originan a partir de diferentes tipos de células. Entre estos factores, se ha establecido un papel para la desregulación de la homeostasis del glutamato en la neurodegeneración mediada por la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En pacientes con ELA, se han documentado niveles elevados de glutamato en plasma , disminución de la captación de glutamato, disminución de los niveles de expresión del transportador de glutamato glial EAAT2  y niveles alterados de glutamina sintetasa .

El veneno de abeja (BV) es una medicina tradicional coreana que se ha utilizado con éxito para tratar enfermedades relacionadas con el sistema inmune, especialmente la artritis reumatoide. EL BV contiene varios péptidos biológicamente activos, que incluyen melittin, apamina, adolapin y péptido degranulador de mastocitos. Informes recientes han indicado que la acupuntura y la administración de BV pueden impartir una respuesta antiartrítica significativa que está mediada por la inhibición de los mediadores inflamatorios, similar a los fármacos antiinflamatorios no esteroideos . Jang y sus colegas han demostrado que EL BV tiene efectos antiinflamatorios en la línea celular de macrófagos Raw264.7 que se pueden atribuir a la regulación negativa transcripcional de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), ciclooxigenasa-2 (COX-2), factor nuclear kappa B (NF- κ B) y proteína quinasas activadas por mitógeno (MAPK) , y un efecto antibacteriano que no tiene efectos secundarios en modelos animales.

En este estudio, informamos que el pretratamiento de células neuronales y microgliales con BV inhibió significativamente la toxicidad mediada por glutamato. La toxicidad mediada por glutamato requirió la cinasa N-terminal quinasa (JNK), la cinasa regulada por señal extracelular (ERK), p38 y las rutas de señalización alfa serina / treonina-proteína quinasa 1 (AKT). Además, el pretratamiento con BV inhibió significativamente la expresión de JNK, ERK y p38 en células neuronales estimuladas con glutamato N2a.

Los presentes resultados pueden tener implicaciones clínicas y sugieren que el BV puede ser un tratamiento potencial para la prevención de enfermedades inflamatorias o neurodegenerativas tales como ELA.

Discusión

Informes recientes sobre enfermedades neurodegenerativas han demostrado que las alteraciones en la expresión y actividad de la proteína quinasa pueden modificar la activación corriente abajo de las proteínas de señalización y desencadenar la pérdida neuronal. El glutamato es el neurotransmisor excitador predominante en el SNC, y la liberación excesiva de glutamato celular se ha relacionado con eventos excitotóxicos en enfermedades neurodegenerativas. En este estudio, determinamos si el BV regula la viabilidad celular y la expresión de proteínas en células normales neuronales y microgliales. Observamos una toxicidad mediada por glutamato dependiente de la dosis tanto en el neuroblastoma N2a como en las células microgliales BV2. Sin embargo, el pretratamiento con BV previo a la estimulación con glutamato protegió a las células de la muerte celular. En el caso de las células BV2, observamos diferentes resultados en los ensayos de LDH y MTT para la viabilidad celular, que sugiere un efecto neuroprotector mediado por BV contra el glutamato (Figuras 2 (b) -2 (c)). Debido a que la liberación de LDH es proporcional a la tasa de pérdida de piruvato, este parámetro puede no evaluar con precisión la viabilidad celular en las células neuronales.

De acuerdo con informes anteriores, el glutamato puede proteger a las neuronas contra la excitotoxicidad mediada por glutamato  o inducir la apoptosis. Los jugadores clave en las respuestas celulares a diversos estímulos incluyen ERK, p38 y JNK. Además, la vía Ras-MAPK está involucrada en varias funciones celulares que incluyen la supervivencia, la potenciación a largo plazo y la plasticidad sináptica . Sin embargo, el papel de la vía MAPK en la protección neuronal es controvertido y depende de la duración de la activación de ERK . Varios informes han sugerido que la vía de señalización MAPK-ERK1 / 2 promueve la supervivencia celular mediante la activación de CREB . La activación de ERK también ha demostrado contribuir a la muerte neuronal en algunos modelos de neurotoxicidad . En este trabajo, encontramos que el BV inhibió la fosforilación inducida por glutamato de ERK, p38 y JNK en células de neuroblastoma N2a y fosforilación de JNK inducida por glutamato en células microgliales BV2. La concentración optimizada de BV (2.5 μ g / mL) aumentó la expresión de phospho-AKT . La activación de MAPKs, incluyendo ERK, p38 y JNK , es promovido por la proteína quinasa C (PKC). Estudios previos han demostrado que ERK está involucrado en las respuestas asociadas al crecimiento y que JNK y p38 se activan por tensiones citotóxicas, incluido el lipopolisacárido tipo citoquina (LPS) . Sin embargo, otros informes han demostrado que el BV aumentó la fosforilación de JNK en Raw 264.7 macrófagos y sinoviocitos. Encontramos que, en las células de neuroblastoma N2a, los niveles de AKT se regulaban positivamente mediante el tratamiento con BV y glutamato y que el BV combinada con la estimulación con glutamato era la más eficaz para aumentar la expresión de AKT en las células de neuroblastoma N2a. Además, observamos una mayor mortalidad celular debido al glutamato en las células microgliales en comparación con las células N2a. Estos resultados sugieren que el BV puede proteger contra el daño glutamatérgico. En células microgliales BV2, el pretratamiento con BV disminuyó la regulación positiva de JNK inducida por glutamato en comparación con las células tratadas con glutamato. Nuestra hipótesis es que el BV podría ser eficaz contra el estrés celular y que puede contribuir a la supervivencia celular a través de la disminución de los niveles de proteína JNK después de la exposición al aumento de las concentraciones de glutamato. Además, el pretratamiento BV aumentó la activación de AKT en células BV2. Además, el BV combinado con el tratamiento con glutamato moderadamente upregulated fosforilación de AKT en células microgliales BV2. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la activación de AKT inducida por BV contribuye a la supervivencia celular tanto en células microgliales BV2 como en células neuronales N2a.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno paralítico fatal caracterizado por la muerte selectiva de las neuronas motoras. Aproximadamente el 10% de los casos de ALS son hereditarios (FALS) y el 90% son esporádicos (SALS). Aproximadamente el 25% de los casos de FALS son causados ​​por mutaciones sin sentido en la enzima expresada ubicuamente Cu 2+ / Zn 2+ superóxido dismutasa (SOD1). Varios informes respaldan un papel del estrés oxidativo en la muerte neuronal durante el envejecimiento y en enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, ALS). Además de las especies reactivas de oxígeno, el glutamato también puede estar involucrado en ALS. Aunque la parálisis en la ELA resulta de la muerte de las neuronas motoras, la autonomía celular de la patogénesis de la ELA ha sido cuestionada por estudios en los que la SOD1 mutante se eliminó selectivamente en microglia y astrocitos; estos estudios enfatizan la contribución de estas células a la patogénesis de ALS.

Hasta donde tenemos conocimiento, este estudio es el primero en demostrar que el  BV inhibe la muerte celular y la activación de la señalización proapoptótica en células estimuladas con glutamato. También mostramos que el BV atenúa la toxicidad celular a través de la inhibición de las vías JNK y p38. Estos hallazgos enfatizan la importancia clínica del BV para el tratamiento de síndromes mediados por glutamato y enfermedades inflamatorias. Investigación adicional de esta actividad en vivoes necesario para elaborar los mecanismos implicados y para permitir la explotación completa del potencial terapéutico del BV. Para probar la efectividad del BV en el tratamiento de ALS, se necesitan estudios futuros para elucidar las respuestas de señalización activadas por glutamato o BV en neuronas de ratones transgénicos hSOD1 mutantes. Además, BV contiene una variedad de péptidos (p. Ej., Melitina y apamina), enzimas (p. Ej., PLA2, histamina y epinefrina), componentes no peptídicos que incluyen lípidos e hidratos de carbono y aminoácidos libres. Por lo tanto, se requiere más investigación para determinar el elemento  bioactivo de BV.