EFECTOS ANTI-ALÉRGICOS Y ANTIINFLAMATORIOS IN VITRO E IN VIVO DE EBV, UN DERIVADO RECIENTEMENTE DESARROLLADO DE VENENO DE ABEJA, A TRAVÉS DE LA MODULACIÓN DE LA RUTA DE SEÑALIZACIÓN IRF3 EN UN MODELO DE EDEMA INDUCIDO POR CARRAGENINA

Hwa-Jin Chung ,  Jinho Lee ,  Joon-Shik Shin ,  Me-riong Kim ,Wonil Koh , Min-Jeong Kim ,  Jae-woong Lee , Eun Jee Kim , In-Hee Lee ,  Won Kyung Kim , Yoon Jae Lee ,  Sang Kook Lee , yIn-Hyuk Ha 

Fondo

El veneno de abeja (BV), un tipo de toxina extraída de las abejas melíferas ( Apis mellifera ), se ha utilizado empírica y ampliamente para tratar enfermedades inflamatorias en toda Asia. Essential BV (eBV) se desarrolló al eliminar la fosfolipasa A2 (PLA2) y la histamina para reducir la aparición de reacciones alérgicas. Este estudio investigó las actividades antialérgicas y antiinflamatorias de eBV in vitro e in vivo y su mecanismo de acción subyacente.

Métodos

El potencial antiinflamatorio de eBV se evaluó in vivo usando un modelo de edema de pata inducido por carragenina. Para investigar adicionalmente el mecanismo mediante el cual eBV ejerce efectos antialérgicos y antiinflamatorios, se estudiaron in vitro células RBL-2H3 estimuladas con compuesto 48/80 y células de macrófago murino RAW 264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) .

Resultados

La liberación de β-hexosaminidasa e histamina se incrementó por eBV de una manera dependiente de la dosis, pero estos niveles fueron menores en eBV en comparación con BV original en la misma concentración. Además, eBV suprimió la expresión inducida por el compuesto 48/80 del factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β) en células RBL-2H3. También se demostró que eBV suprime la producción de óxido nítrico (NO) mediante la regulación por disminución de la expresión de ARNm y la posterior expresión proteica de mediadores inflamatorios en células RAW 264.7 inducidas por LPS. La fosforilación de activadores y transductores de señal de transcripción 1 / factor regulador 3 del interferón (STAT1 / IRF3) se atenuó mediante tratamiento con eBV. El eBV inhibió significativamente el edema agudo inducido por carragenano in vivo . Los niveles séricos de prostaglandina E2 (PGE2), TNF-α e IL-1β también se redujeron mediante eBV.

Conclusiones

Estos resultados demuestran que eBV inhibe la respuesta alérgica e inflamatoria reduciendo la producción de mediadores inflamatorios a través de la regulación de la vía de señalización STAT1 / IRF3, lo que sugiere que eBV es un candidato factible para la regulación de la respuesta alérgica-inflamatoria en medicina complementaria y alternativa.

Introducción
El veneno de abeja (BV) es la toxina secretada por ovipositores de abejas melíferas ( Apis mellifera ). Tiene una densidad de 1.3, pH de 5.2, sabor amargo y carácter aromático débil. Setenta y cinco por ciento de BV se compone de varios péptidos y proteínas, es decir, melittin, apamina, mastocitos desgranulado (MCD) péptido, fosfolipasa A2 (PLA2), adolapine, hyaluronidase, e histidina . Se ha informado que el BV es eficaz contra la artritis , la aterosclerosis , el dolor lumbar , la cicatrización de la piel , los microbios , la inflamación y el blanqueamiento de la piel y las arrugas  La melitina, ampliamente aceptada como el principal componente activo en BV, ha demostrado poseer efectos analgésicos  y antiinflamatorios , y comprende más del 50% del BV.
En Asia, la acupuntura con BV se ha practicado tradicionalmente utilizando el aguijón de las abejas vivientes para estimular ciertos puntos de acupuntura. Sin embargo, varios desafíos han surgido en la aplicación de esta intervención. En un intento de superar tales desafíos, la toxina en los ovipositores de abejas vivas se extrae mediante estimulación eléctrica, luego se seca y se purifica. Las propiedades reportadas de la farmacoterapia BV incluyen efectos antiinflamatorios  y analgésicos , y la modulación del sistema inmune , y se ha informado que la farmacoterapia con BV es efectiva contra la artritis reumática , la hernia lumbar del disco intervertebral , y artritis de rodilla degenerativa  en varios estudios clínicos.
A pesar de sus numerosos beneficios, las reacciones alérgicas que se ha informado que ocurren durante el tratamiento de BV siguen siendo una carga tanto para los médicos como para los pacientes. La hipersensibilidad sistémica especialmente inmediata, también conocida como shock anafiláctico, que se presenta en individuos alérgicos a la BV, presenta una amenaza rara pero sustancial. Las sustancias que se sabe que son las principales responsables de las reacciones alérgicas son la PLA2 y la histamina, que conllevan problemas de seguridad para los pacientes sensibles al BV .
El término alergia se refiere a una reacción inmunológica hipersensible a antígenos no dañinos (conocidos como alérgenos ) que ocurren cuando el sistema inmune es disfuncional por causas congénitas o adquiridas. Tras una respuesta inflamatoria o alérgica, los macrófagos activados presentan antígenos y secretan citoquinas inflamatorias tales como TNF-α, IL-4, MCP-1, IL-8 e IL-13. Estas citoquinas conducen a la respuesta inflamatoria a través de la diferenciación y la maduración de otras células proinflamatorias y la síntesis de inmunoglobulina, lo que resulta en una mayor inflamación alérgica.
La inflamación es un mecanismo de autodefensa fisiológica que se desencadena a través del daño sistémico o local causado por factores tales como infección, patógenos o estrés , y generalmente se clasifica como aguda o crónica.
Durante el proceso inflamatorio, LPS se une al complejo de Toll-like receptor-4 (TLR4) y mieloide de diferenciación de proteína-2 (MD-2), lo que induce la respuesta inflamatoria en macrófagos .  El TLR4 activado transmite luego las señales aguas abajo a través de la vía dependiente del factor de diferenciación mieloide-88 (Myd-88) y la proteína adaptadora que contiene el dominio TIR, induciendo la activación de la vía dependiente de IFN-β (TRIF). En la vía dependiente de TRIF, el factor regulador de interferón fosforilado 3 (IRF3) se transloca al núcleo y se une a la región promotora, regulando por incremento la expresión de ARNm de tipo 1 de IFN. En consecuencia, IFN tipo 1  se une a Janus quinasas (JAK) y fosforila el transductor de señal y activador de transcripción-1 (STAT1), y STAT1 fosforilada, a su vez, se transloca al núcleo y actúa como un factor de transcripción que promueve la expresión de factores inflamatorios tales como NO y PG. Por lo tanto, la modulación de tales vías a través de la supresión de mediadores inflamatorios específicos puede considerarse en los enfoques de tratamiento de la enfermedad inflamatoria .
En el presente estudio, BV esencial (eBV) se desarrolló mediante la eliminación de PLA2 y la histamina para garantizar el uso seguro de BV refinado y prevenir contra los efectos adversos.
Discusión
Con el aumento de la esperanza de vida y el mayor interés en mejorar la calidad de vida (CdV), la necesidad de un tratamiento efectivo y prevención de enfermedades modernas está creciendo, con especial énfasis en los procesos inflamatorios, ya que se sabe que están estrechamente relacionados con patologías como el cáncer. Enfermedad de Alzheimer y aterosclerosis. Varias alternativas de tratamiento en medicina complementaria y alternativa se están explorando en un intento de tratar tales enfermedades altamente correlacionadas con el estilo de vida .
Se han realizado numerosos estudios sobre componentes bioquímicos, actividad farmacológica, mecanismos subyacentes, hipersensibilidad y toxicidad de VB, y aunque dos estudios sobre la seguridad BV informaron que las sensaciones estimulantes y las reacciones edematosas ocupan la mayoría de los casos de reacciones de hipersensibilidad , incidencia del shock anafiláctico, aunque raro, se debe referir con precaución.
Recientemente, las investigaciones sobre el BV eliminada la posibilidad de de alérgenos informaron efectos sobre el blanqueamiento, el cuidado de las arrugas y la antiinflamación a través de la supresión de la generación de NO. Aún así, hay una escasez de estudios comparativos sobre el potencial antiinflamatorio y antialérgico del BV original y BV refinado libre de alérgenos, y el estudio actual tiene importancia en el examen del efecto antialérgico de eBV in vitro , y el actividad antiinflamatoria de eBV tanto in vitro como in vivo .
El análisis por HPLC se realizó con eBV para determinar la presencia de alérgenos primarios conocidos; BV, PLA2 e histamina. Los resultados demostraron que la concentración de PLA2 e histamina disminuyó en eBV después del aislamiento y la purificación, lo que condujo a un aumento relativo de la concentración de melitina, el principal compuesto activo de eBV .
La β-Hexosaminidasa y la histamina se liberan cuando las células cebadas son activadas por antígenos o estimulación inmunológica. Por lo tanto, son considerados marcadores de desgranulación en experimentos in vitro de respuesta alérgica . El compuesto 48/80 es una molécula conocida por inducir la desgranulación de los mastocitos durante la respuesta alérgica . En los resultados actuales, se encontró que eBV suprime significativamente la secreción de β-hexosaminidasa e histamina inducida por el compuesto 48/80 ( p <0.01), y el efecto supresor de eBV fue mayor que el de BV original . Aunque eBV se preparó para estar libre de histamina y PLA2, BV contiene varios alergenos. Además, se ha demostrado que la melitina en sí misma induce reacciones alérgicas e inflamatorias bajo ciertas condiciones . Sin embargo, las propiedades antiinflamatorias de BV y melitina descritas en la literatura previa sugieren un beneficio terapéutico  y la farmacoterapia BV es ampliamente utilizada en la práctica de la medicina coreana. Los autores también han llevado a cabo un ensayo clínico que compara los efectos adversos locales y antiinflamatorios y la reacción alérgica a BV y eBV, que actualmente se envía para su publicación. El presente estudio tiene importancia porque la actividad antialérgica del eBV sin alérgenos es mayor que la del BV original in vitro .
Cuando se activan, los mastocitos expresan y liberan citoquinas inflamatorias, que a su vez modulan el proceso inflamatorio. La IL-1β activa los mastocitos mediante la mediación de IgE e induce a las células a liberar histamina y citocina Th2, lo que contribuye a la progresión de la inflamación alérgica mediada por IgE. El TNF-α es una citocina proinflamatoria que se libera durante la fase temprana de la respuesta inmunológica y se sabe que está implicada en la modulación de la inflamación alérgica . La IL-4 potencia la síntesis de IgE e induce reacciones alérgicas de tipo 1 inmediatas al ayudar a las células B a transformarse para expresar IgE y a regular la IL-5, que es crucial para la diferenciación de los eosinófilos. Mientras que la secreción y la expresión de ARNm de TNF-α e IL-4 en las células RBL-2H3 estimuladas con compuesto 48/80 aumentaron significativamente ( p <0,01), se mostró la expresión en células pretratadas con eBV antes de la estimulación del compuesto 48/80 ser significativamente menor que el control ( p <0.01; . Se observó el efecto inhibidor de eBV eliminado de PLA2 e histamina en la respuesta alérgica. Por lo tanto, se espera que la utilización de eBV sea beneficiosa en términos de menos efectos adversos clínicos, incluyendo dolor e hinchazón.
El papel de los macrófagos en la generación NO es, hasta el momento, controvertido . La activación de los macrófagos en la inflamación alérgica y el efecto consiguiente sobre el NO como mediador de la inflamación se investigaron en el estudio actual. En el ensayo iNOS, se descubrió que el eBV inhibe la generación de NO de una manera dependiente de la dosis, y el ensayo MTT confirmó que el resultado no se debió a una citotoxicidad significativa . Además, eBV suprimió la expresión de iNOS y COX-2 de forma dependiente de la dosis. Las citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α e IL-1β son conocidos por ser regulados hasta durante la respuesta inflamatoria, y la expresión de TNF-α y la IL-1β también fueron suprimidos por EBV en una manera dependiente de la dosis .
NF-κ B se conoce como el factor de transcripción central que regula los mediadores inflamatorios como iNOS, COX-2 y TNF-α . Cuando está inactivo, NF-κB permanece en el citoplasma como un heterodímero que consiste en las subunidades p50 y p65, unidas a IκB, el inhibidor de la proteína NF-κB. Cuando NF-κB es activado por estimulantes tales como LPS, la fosforilación y degradación de IκB permite que NF-κB se active y se transloque en los núcleos, actuando posteriormente como un factor de transcripción. Los resultados del análisis de Western blot revelaron que eBV suprimía la degradación de IκB y la translocación intranuclear de p-p65. El eBV también inhibió el aumento estimulado por LPS de la actividad transcripcional de NF-κB de una manera dependiente de la dosis .
Además, se examinó el efecto inhibidor de eBV sobre la transcripción mediada por NF-κB con respecto a la vía dependiente de TRIF. Como se muestra en los hallazgos actuales, eBV inhibió la fosforilación de IRF3, la señal descendente de la ruta dependiente de TRIF, conduciendo a la expresión regulada por disminución de IFN-β, cuya transcripción se inicia mediante IRF3 fosforilado. Además, la fosforilación de STAT1 y STAT3, la secuela de IFN-β, también se suprimió por eBV de una manera dependiente de la dosis. Los hallazgos anteriores ilustran que el eBV, eliminado de alérgenos, puede actuar como un potente inhibidor de diversos mediadores inflamatorios.
La inflamación aguda se acompaña de síntomas característicos como edema, dolor y pérdida de la función. El cambio edematoso es uno de los principales indicadores de respuesta inflamatoria . Se estudió el modelo de edema agudo de pata inducido por carragenina con el objetivo de explorar más el potencial antiinflamatorio de eBV in vivo . Como se muestra en el resultado del estudio, eBV suprimió el edema de la pata inducido por carragenina de forma dependiente de la dosis. Además, se investigó el tejido de la pata edematosa para diversas proteínas inflamatorias. Se descubrió que eBV suprime significativamente el aumento inducido por carragenina en proteínas tales como iNOS, COX-2, TNF-α e IL-1β en el tejido local. Por otra parte, los niveles séricos de PGE2, TNF-α e IL-1β se redujeron mediante el tratamiento con eBV. Estos resultados implican que eBV ejerce potentes efectos antiinflamatorios tanto in vivo como in vitro .
En conclusión, se demostraron los efectos antialérgicos y antiinflamatorios del eBV usando modelos inflamatorios alérgicos in vitro e in vivo . Se descubrió que el eBV eliminado los alérgenos ejerce un potencial antialérgico, y se puede conjeturar que el eBV muestra un efecto antiinflamatorio a través de la regulación de la ruta de señalización de IRF3 y sus factores descendentes. Por lo tanto, el eBV puede considerarse un candidato factible en el abordaje terapéutico de la enfermedad inflamatoria usando medicina complementaria y alternativa.