ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL VENENO DE ABEJA Y LA MELITINA CONTRA BORRELIA BURGDORFERI

Kayla M. Socarras , Priyanka AS Theophilus , Jason P. Torres , Khusali Gupta yEva Sapi *

Abstracto

La enfermedad de Lyme es una enfermedad multisistémica transmitida por garrapatas, causada por la bacteria Borrelia burgdorferi. Aunque los antibióticos se usan como tratamiento primario, la recaída a menudo ocurre después de la interrupción de los agentes antimicrobianos. El motivo de la recaída sigue siendo desconocido, sin embargo, estudios previos sugieren la posible presencia de cuerpos redondos borrelia resistentes a los antibióticos, persistentes y formas de biofilm adjuntas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de encontrar agentes antimicrobianos adecuados para eliminar todas las formas conocidas de B. burgdorferi . En este estudio, agentes antimicrobianos naturales como el veneno de Apis mellifera  y un componente conocido, melitina, se probaron usando SYBR Green I / PI, conteo directo de células, ensayos de biopelícula combinados con LIVE / DEAD y métodos de microscopía de fuerza atómica. Los resultados obtenidos se compararon con el tratamiento independiente y combinaciones de antibióticos como doxiciclina, cefoperazona y daptomicina, que recientemente se descubrió que eran efectivos contra Borrelia persisters. Nuestros hallazgos mostraron que tanto el veneno de abeja como la melitina tuvieron efectos significativos en todas las formas probadas de B. burgdorferi. Por el contrario, los antibióticos de control cuando se usan individualmente o incluso en combinaciones tienen efectos limitados sobre la forma de biopelícula adjunta. Estos hallazgos sugieren fuertemente que el veneno de abeja entero o la melitina podrían ser agentes antimicrobianos efectivos para B. burgdorferi; sin embargo, es necesario realizar más investigaciones para evaluar su efectividad in vivo, así como su método de administración seguro y eficaz para su uso terapéutico.

 Introducción

A través de los años, la gravedad de las enfermedades infecciosas y la incapacidad de tratarlas de manera efectiva con antibióticos se han convertido en una epidemia de rápido crecimiento. Una de esas enfermedades que se ha extendido a través de los Estados Unidos, Europa, Asia, Australia y en algunas partes de África es la borreliosis de Lyme, también conocida como enfermedad de Lyme . El agente causal conocido de la enfermedad de Lyme es Borrelia burgdorferi , que se transmite principalmente a través de garrapatas Ixodid . De acuerdo con el Centro de Control de Enfermedades, los Estados Unidos tienen aproximadamente 300,000 nuevos casos de enfermedad de Lyme reportados cada año. A las personas diagnosticadas con éxito a menudo se les recetan antibióticos como doxiciclina, amoxicilina y ceftriaxona; sin embargo, estudios recientes demostraron que estos antibióticos son insuficientes para eliminar ciertas formas de Borrelia spp. in vitro e in vivo .

Borrelia spp., Por su definición tradicional, es una bacteria espiroqueta con flagelos internalizados , sin embargo, también se identificaron otras formas morfológicas como cuerpos redondos, persistentes de fase estacionaria y formas de biopelícula . B. burgdorferi puede transformarse entre estas morfologías dependiendo de su entorno . Algunos factores que causan estas diferentes formas son ciertas condiciones desfavorables, tales como cambios en el pH, inanición de nutrientes, ataques al sistema inmune del huésped, o incluso antibióticos podrían promover estos cambios morfológicos . Se informó que estas formas defensivas tienen una alta resistencia a los agentes antimicrobianos que actualmente se usan para tratar la enfermedad de Lyme . Por ejemplo, mientras que la doxiciclina es muy efectiva eliminando espiroquetas in vitro, no redujo las persistencias y / o biopelículas resilientes a los antibióticos.  Además, se demostró que ninguno de los antibióticos actualmente utilizados para tratar la enfermedad de Lyme es eficaz contra la “persistencia” y las formas de biofilm adjuntas de Borrelia . También se informó que varios antibióticos (cefoperazona, daptomicina) podrían tener potencial para eliminar eficazmente persistentes de Borrelia, especialmente cuando se combinan con doxiciclina . Lamentablemente, adjunta Borrelia las biopelículas, que recientemente se comprobó que estaban presentes en los tejidos infectados de la piel humana, no respondieron bien a estas nuevas combinaciones de antibióticos .

Teniendo en cuenta los efectos limitantes que los antibióticos estándar pueden tener sobre las morfologías de Borrelial, nuestro grupo de investigación comenzó a buscar posibles antimicrobianos alternativos. En un estudio reciente, se encontró que el extracto de hoja de Stevia rebaudiana era muy efectivo en la eliminación de todas las formas morfológicas conocidas de Borrelia, incluidas las biopelículas unidas . Con base en estos hallazgos, buscamos agentes alternativos adicionales que también puedan tener un efecto similar. Un agente alternativo es la apitoxina, también conocida como veneno de abeja, derivada del insecto Apis mellifera, más conocida como abeja melífera. El uso de este veneno ha sido documentado por sus propósitos medicinales hace aproximadamente 6000 años y varios estudios han demostrado sus efectos antimicrobianos . En un estudio previo, se demostró que el componente melitina del veneno de abeja tiene efectos significativos sobre las espiroquetas de Borrelia a concentraciones de MIC de 100 μg / ml . Los datos recientes muestran valores similares de CIM para la melitina cuando se usan para tratar otros microorganismos gramnegativos como Salmonella enterica Yersinia kristensenii . En este informe, ampliamos estos hallazgos al probar la sensibilidad de diferentes formas de B. burgdorferi al veneno de abeja y su componente melitina en comparación con los antibióticos recientemente encontrados efectivos contra las formas de persistencia de Borrelia. Para evaluar la sensibilidad antimicrobiana del veneno de abeja y melitina, se utilizaron métodos previamente publicados como el ensayo SYBR Green I / PI combinado con recuento de células vivas directas totales para espiroquetas de fase logarítmica y persistentes de fase estacionaria , mientras que las biopelículas adjuntas se analizaron mediante cristal violeta y LIVE / DEAD técnicas de tinción [ 6 ]. Los métodos de microscopía de fuerza fluorescente y atómica también se emplearon para visualizar mejor el efecto de estos agentes antimicrobianos en Borrelia.

 Discusión

La bacteria espiroqueta B. burgdorferi  es el principal agente patológico de la enfermedad de Lyme en América del Norte y Europa . Si bien esta enfermedad infecciosa puede tratarse con antibióticos, ha habido un aumento en la resistencia a los antibióticos en los últimos años . Por lo tanto, se han realizado grandes esfuerzos para encontrar nuevos compuestos antimicrobianos que puedan ayudar en el tratamiento de la enfermedad de Lyme. En este estudio, el veneno de abeja entera, así como su componente, melittin, se probaron en diferentes formas de Borrelia. Esta idea se basó en un estudio anterior prometedor, que demostró que la melitina afectaba significativamente a B. burgdorferi sensu stricto spirochetes al disminuir la motilidad de la bacteria y su crecimiento ]. Los efectos del veneno de abeja y la melitina se compararon con los antibióticos de un estudio que utilizó la biblioteca de medicamentos de la FDA para encontrar agentes altamente efectivos para B. burgdorferi . El estudio también confirmó varios hallazgos previos de que no todos los antibióticos que se utilizan para el tratamiento de la enfermedad de Lyme son efectivos en todas las formas morfológicas de B. burgdorferi. Un estudio posterior demostró que las combinaciones de antibióticos recientemente descubiertas que fueron efectivas para Borrelia persisters  tuvieron un efecto limitado en las biopelículas de Borrelia adjuntas . Por lo tanto, nuestro estudio tuvo como objetivo evaluar si el veneno de abeja y la melitina podrían ser efectivos para todas las formas morfológicas de Borrelia.

Utilizamos varios métodos diferentes para evaluar el efecto de todos los antibióticos y antimicrobianos y descubrimos que ciertas técnicas como SYBR Green I / PI debían confirmarse con ensayos adicionales. Una posible explicación de los hallazgos es que el ensayo SYBR Green I / PI podría verse afectado por los componentes autofluorescentes de las células moribundas como se informó anteriormente para Escherichia coli tratados con antibióticos . Se sugirió que la muerte celular podría desencadenar cambios en los componentes celulares intrínsecos y producir compuestos químicos fluorescentes .

Con base en los hallazgos de diferentes técnicas, concluimos que tanto el veneno de abeja entera como la melitina podrían tener efectos significativos en todas las formas morfológicas de Borrelia, incluida la inhibición de la recuperación de células espiroquetas y persiste como lo demuestran los cultivos de recuperación en medios libres antimicrobianos. El veneno de abeja entera y la melitina también redujeron significativamente el número y / o la viabilidad de las biopelículas unidas, que según investigaciones previas, es la forma más resistente a antibióticos de B. burgdorferi . Los valores de concentración de MIC para la melitina, por ejemplo, concuerdan bien con los estudios previos que evaluaron la melitina en Borrelia spirochetes  y en varios otros microorganismos gramnegativos tales como S. enterica y Y. kristensenii .

La comparación de los efectos observados del veneno de abeja entero y la melitina en Borrelia mostró algunas diferencias, sin embargo. Por ejemplo, los análisis de ultraestructura utilizando microscopía de fuerza atómica revelaron que el tratamiento con veneno de abeja entero tenía más efecto sobre la morfología y el tamaño de las biopelículas , lo que sugiere la complejidad de la respuesta del biofilm a los agentes antimicrobianos, lo que requiere mayor investigación. Las diferencias en el veneno de abeja y la efectividad de la melitina en B. burgdorferi sugieren que puede haber otros componentes dentro del veneno de abeja entero, que también tienen un efecto sobre las biopelículas de Borrelia. Se informaron hallazgos similares en un estudio reciente que evaluó diferentes extractos de Stevia de hojas enteras en B. burgdorferi  que encontró que mientras los extractos de hojas de Stevia enteros eran efectivos, su componente conocido no era esteviósido. Los resultados sugirieron que otros componentes dentro del extracto de hoja entera de Stevia podrían afectar a Borrelia ya sea individualmente o en una capacidad potencialmente sinérgica con esteviósido. Además, los antibióticos estándar utilizados en este estudio tuvieron poco o ningún efecto sobre las formas de biofilm adjuntas de B. burgdorferi . Hallazgos similares se observaron en estudios previos sobre Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus , que encontraron que los antibióticos no podían eliminar la forma de la biopelícula y, en algunos casos, incluso podían aumentar su tamaño. En nuestro estudio, se encontró un resultado similar para Doxycycline; en realidad aumentó la masa de biofilm Borrelia adjunta, una observación que aceptó los hallazgos previamente publicados .

Se ha demostrado en estudios anteriores que el veneno de abeja tiene una amplia gama de aplicaciones para reducir o incluso eliminar dolencias  que pueden explicarse por la multitud de componentes del veneno de abeja que le dan su propiedades. Un tipo de componente, llamado péptidos antimicrobianos, no solo podía eliminar los patógenos, sino que también podía afectar la inflamación, mejorar la cicatrización e incluso tener un comportamiento anti-biopelícula en diferentes microorganismos. Además, estos péptidos específicos también podrían afectar la capacidad de las bacterias para crear biofilms completamente funcionales . Por lo tanto, es vital comprender los componentes utilizados en el estudio para comprender su importancia como tratamiento antimicrobiano.

La melitina es un pequeño péptido antimicrobiano α-helicoidal anfipático de 26 aminoácidos y comprende aproximadamente el 50% del veneno de abeja entero utilizado en nuestro estudio . Los péptidos antimicrobianos en el veneno de abeja, incluyendo melitina y fosfolipasa A 2 , han sido un tema de interés dentro de la comunidad científica, debido a la versatilidad de su función en la inmunidad innata, así como a minimizar las reacciones inmunológicas adversas cuando se usan en combinación con otros compuestos. En este estudio, la fosfolipasa A 2 también se probó a diferentes concentraciones, pero no mostró ningún efecto significativo sobre ninguna de las formas morfológicas de Borrelia .

En los últimos años, se ha centrado en la melitina y su mecanismo de acción para atacar diferentes microbios . Este péptido antimicrobiano, similar a la mayoría de su clase, es anfipático. Esto permite la integración de melitina en bicapas de fosfolípidos diana en bajas concentraciones, mientras que en altas concentraciones se homodimeriza para formar poros, liberando iones Ca 2+ o alterando los grupos de cabeza de fosfolípidos . En B. burgdorferi, los iones Ca 2+ se utilizan para el desarrollo de una cubierta externa protectora para biofilms maduros, para la evasión de la resistencia potencial del huésped . El mecanismo específico de acción de la melitina, al igual que otros péptidos antimicrobianos, depende de la composición bicapa de fosfolípidos de la bacteria diana, así como de la evasión de tratamientos antimicrobianos comunes que podrían afectar las ubicaciones de unión de los péptidos a la membrana celular.

Se sabe que los péptidos antimicrobianos tienen una actividad muy alta hacia las membranas microbianas con bajo desarrollo de resistencia a los antimicrobianos . Una de las razones importantes por las que la estructura del biofilm podría proporcionar una alta resistencia a los antibióticos se debe principalmente a la presencia de poblaciones microbianas inactivas (durmientes) dentro de las biopelículas. Estos biofilms son muy difíciles de matar con antibióticos estándar, que a menudo dependen de células en crecimiento activo . El uso de ciertos péptidos antimicrobianos como la melitina podría eliminar este problema al permeabilizar las membranas microbianas, lo que da como resultado la disrupción de la membrana y la muerte celular, incluso para las células inactivas en el centro de la biopelícula. Curiosamente, sin embargo, los hallazgos recientes indican que los péptidos antimicrobianos también pueden tener un objetivo intracelular que afecta a la síntesis de ácidos nucleicos y / o proteínas, incluso a los pliegues de proteínas. Sin embargo, se necesitan estudios futuros para evaluar si esto es cierto para la melitina.

Otro enfoque en publicaciones recientes sobre el veneno de abeja o la melitina es la efectividad clínica de estos antimicrobianos naturales en diferentes enfermedades. Melittin, por ejemplo, demostró tener una actividad inmunorreguladora muy fuerte, efecto anticancerígeno e incluso se muestra prometedor como la quimioterapia de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Desafortunadamente, se plantearon varios problemas en cuanto a la administración segura de melitina en el entorno clínico, debido a su citotoxicidad para las células humanas; por ejemplo, tiene la capacidad de lisar eritrocitos humanos, exhibe actividad necrótica contra las células epiteliales gastrointestinales y vaginales y puede desencadenar reacciones alérgicas graves . Para reducir los efectos citotóxicos, estudios recientes mostraron que la melitina podría combinarse con diversos agentes farmacéuticos para eliminar específicamente las células cancerosas, lo que condujo a ensayos clínicos más prometedores. En otro esfuerzo por reducir la citotoxicidad de la melitina, la melitina se unió a una nanopartícula que protegía a las células humanas normales mientras ataca de manera eficiente las células infectadas por el VIH (Hood et al., 2013). Los resultados de estos estudios podrían ayudar a promover el diseño de un enfoque novedoso para la aplicación exitosa de veneno de abeja o melitina en el tratamiento contra B. burgdorferi, así como otros microbios patógenos.