LOS EXTRACTOS DE PROPÓLEOS RICOS EN POLIFENOLES FORTALECEN LA FUNCIÓN DE BARRERA INTESTINAL MEDIANTE LA ACTIVACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN AMPK Y ERK

Kai Wang ,  Xiaolu Jin ,  Yifan Chen ,  Zehe Song ,  Xiasen Jiang,  Fuliang Hu ,  Michael A. Conlon ,  y David L. Topping

Introducción
El propóleo es una sustancia derivada de plantas recogida por abejas ( Apis mellifera L.) de diversas fuentes . Los constituyentes polifenólicos abundantes, principalmente flavonoides y ácidos fenólicos, han sido identificados en el propóleo . Tiene actividades farmacológicas bien documentadas, incluyendo efectos antimicrobianos, antioxidantes, antiinflamatorios, inmunomoduladores y cardioprotectores, y se usa ampliamente como alimento saludable / funcional en todo el mundo .
La barrera de la mucosa intestinal se compone principalmente de células epiteliales intestinales (IECs) en el lado luminal y las uniones estrechas (TJ) entre IECs . Esta barrera permite el transporte transcelular de nutrientes esenciales y controla la difusión de macromoléculas luminales y bacterias a través de la mucosa intestinal. La disfunción o destrucción de TJ siempre se acompaña de una interrupción de la barrera mucosal intestinal, que conduce a la penetración de xenobióticos / toxinas en el lumen, que activa el sistema inmune intestinal como puede ocurrir en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) 5 . A pesar de varias terapias farmacológicas para la EII (que dependen principalmente de fármacos anti-inflamatorios), un buen número de pacientes todavía no logran la remisión completa.
TJs función para mantener la barrera intestinal física intacta . Se componen de múltiples proteínas transmembrana (p. Ej., Occludina, claudinas y moléculas de adhesión de unión), e interactúan con proteínas adaptadoras citosólicas, como las zonas occludens (ZO)-1, 2 y 3. La cooperación entre la occludina y ZO-1 Un papel crítico en el mantenimiento de las estructuras normales TJ y la función de barrera epitelial intestinal [ 8 ]. Evidencias recientes sugieren que la permeabilidad de TJ y las proteínas TJ están reguladas por varias vías de señalización intracelular, como la cascada de proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK). La activación de estas vías depende de diversos requisitos fisiológicos y patológicos desafíos . Estudios in vitro utilizando la línea de células epiteliales intestinales humanas Caco-2 han puesto de relieve sus funciones en la regulación de la permeabilidad TJ y la expresión de las proteínas TJ [. Para evaluar la integridad de TJs, microscopía electrónica (microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM)) se puede utilizar para observar los espacios intercelulares y la ultraestructura entre / dentro de IECs vecinas . Además, la permeabilidad TJ a través de la vía paracelular puede medirse por resistencia eléctrica transepitelial (TER) o flujo trazador (por ejemplo, utilizando rojo de rutenio, FITC-dextrano o 3 H-manitol) . Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM)) para observar los espacios intercelulares y la ultraestructura entre / dentro de las IEC vecinas . Además, la permeabilidad TJ a través de la vía paracelular puede medirse por resistencia eléctrica transepitelial (TER) o flujo trazador (por ejemplo, utilizando rojo de rutenio, FITC-dextrano o 3 H-manitol) . Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM)) se pueden utilizar para observar los espacios intercelulares y la ultraestructura entre / dentro de IECs vecinas . Además, la permeabilidad TJ a través de la vía paracelular puede medirse por resistencia eléctrica transepitelial (TER) o flujo trazador (por ejemplo, utilizando rojo de rutenio, FITC-dextrano o 3 H-manitol) .
Existe un interés creciente en el desarrollo de nuevos reactivos terapéuticos contra la EII que aumentan la función de barrera intestinal. Estudios recientes han demostrado que la ingesta abundante de alimentos ricos en polifenoles, como té verde, café, bayas, uvas y otras frutas / verduras, tiene un efecto beneficioso en el mantenimiento de una barrera intestinal intacta y aumenta la expresión de proteínas relacionadas con TJ Occludin, claudin-1, y ZO-1) . Se ha demostrado que los extractos de propóleos ricos en polifenoles (PPE) tienen potentes efectos contra diversas enfermedades inflamatorias, incluida la colitis . Las propiedades anti-bacterianas de PPE también han sido ampliamente investigados y estos estudios sugieren un papel en la regulación de la microbiota intestinal .
En el presente estudio, estudiamos los efectos del PPE sobre la función de barrera intestinal en monocapas de células Caco-2. También probamos la señalización AMPK y MAPK en respuesta al tratamiento con EPI con respecto a la integridad TJ. Además, las ratas fueron alimentadas con dietas suplementadas con PPE para investigar las expresiones TJ del colon.

Discusión
Los polifenoles, que contienen más de 8000 compuestos identificados, figuran entre los grupos de sustancias más numerosos y ampliamente distribuidos en las plantas . Un número creciente de estudios han proporcionado evidencia de las propiedades promotoras de la salud de los polifenoles [. Los polifenoles dietéticos (tanto moléculas puras como en mezclas como extractos polifenólicos vegetales) han sido sugeridos como terapias de apoyo para la salud intestinal. Aquí, proporcionamos la primera evidencia de que el PPE podría tener efectos beneficiosos directos sobre la función de barrera en células epiteliales intestinales humanas Caco-2 y en colones de rata. Además, se encontró que la regulación del conjunto TJ está relacionada con la activación de la señalización AMPK y ERK.
Es ampliamente conocido que la función intacta de la barrera intestinal es extremadamente importante para el mantenimiento de una prevención sana del intestino y del patógeno. Las células Caco-2 epiteliales intestinales humanas se usan ampliamente como un modelo in vitro para evaluar la función de barrera intestinal. Hemos encontrado que el PPE podría aumentar significativamente la integridad TJ mediante el aumento de TER y la disminución de la LY permeabilidad de Caco-2 monocapas cultivadas ( Figura 1 A]. La función de barrera intestinal puede ser potenciada o alterada por una amplia gama de sustancias , incluyendo nutrientes dietéticos, como aminoácidos, polisacáridos y polifenoles, o derivados, como SCFA . Alimentos ricos en polifenoles como el té verde, cacao, Y los frutos pueden mejorar la función barrera intestinal , lo que sugiere que el propóleos, que también es rico en polifenoles, también puede promover la integridad de la barrera intestinal. Componentes polifenólicos como la quercetina y kaempferol, que se han demostrado para mejorar la función de barrera , también están presentes en nuestras muestras de EPI , y es probable que contribuyan a los efectos beneficiosos TER observado en nuestro estudio. Dado que los patrones de expresión y distribución de la proteína TJ son los principales determinantes de la función de barrera intestinal, es probable que los polifenoles abundantes en EPP hayan actuado para mejorar la función de barrera influyendo en las proteínas TJ. Por lo tanto,
TJ formación y montaje implican un complejo de proteínas que se regulan por varias cascadas de señalización, incluyendo quinasas, fosfatasas o proteínas G . Recientemente se ha acumulado un conjunto significativo de pruebas que indican que la diafonía entre diversas vías de señalización regula la formación, así como el desmontaje, de los TJs. AMPK regula varias proteínas importantes membrana de transporte . Es una quinasa de detección metabólica implicada en la generación de ATP en las células. Según estudios recientes, la AMPK activada promueve la formación de TJ. El fosfatidilinositol 3-quinasa / Akt vía es conocido como un importante regulador de la proliferación de células intestinales y la permeabilidad intestinal .
La intracelular de señal de transducción MAPK familia es una de las mejores características de las vías de señalización intracelular . ERK, la quinasa c-Jun N -terminal (JNK) y las subfamilias p38 son los miembros MAPK más caracterizados. Usando células Caco-2 humanas, encontramos que el tratamiento con EPP condujo a la fosforilación de ERK1 / 2 y p38, pero no JNK. Esto fue coherente con nuestro estudio anterior utilizando murinos RAW 264,7 macrófagos, pero inconsistente con los estudios de neurona-como PC12 y fibroblastos células . Cabe señalar que la vía MAPK tiene un papel complicado en la regulación TJ y se han comunicado resultados contradictorios. Kinugasa et al . Encontró que ERK1 / 2 de activación conduce a un aumento TER células intestinales epiteliales y la regulación positiva de TJ claudin-1 y 2 mRNA expresiones . Resultados similares se han encontrado utilizando epiteliales renales LLC-PK1 células . Sin embargo, el factor de necrosis tumoral (TNF-α), la mayor citoquina proinflamatoria en la EII, aumenta la permeabilidad intestinal y resultará en la rápida activación de ERK1 / 2 y una miosina cadena ligera quinasa dependiente de la apertura de intestino TJ . Wu et al . Encontró que la regulación negativa de las proteínas de unión estrecha podría estar relacionado con la activación de MAPK p38 en un modelo de lesión gástrica inducida por clopidogrel . Aquí, Encontramos que el PPE inducida por los cambios en los valores de TER por PPE se previenen en Caco2 células donde AMPK y ERK1 / 2 señalización se inhibió. Sin embargo, los efectos de estos inhibidores en las proteínas de unión estrecha todavía necesitan ser clarificados en el futuro, considerando que los inhibidores farmacológicos tales como los utilizados en el presente estudio pueden inhibir otras quinasas. Curiosamente, la inhibición de p38-MAPK mostró efectos contradictorios, ya que los valores de TER mostraron mayores aumentos. Estos resultados sugieren fuertemente que la activación de p38 MAPK tiene un papel negativo en la regulación de la permeabilidad de las células Caco-2. Hasta donde sabemos, estos datos proporcionan evidencia directa de que el PPE activa la señalización de ERK1 / 2 y AMPK en células epiteliales intestinales. Los efectos de estos inhibidores en las proteínas de unión estrecha todavía necesitan ser clarificados en el futuro, considerando que los inhibidores farmacológicos tales como los utilizados en el presente estudio pueden inhibir otras quinasas. Curiosamente, la inhibición de p38-MAPK mostró efectos contradictorios, ya que los valores de TER mostraron mayores aumentos. Estos resultados sugieren fuertemente que la activación de p38 MAPK tiene un papel negativo en la regulación de la permeabilidad de las células Caco-2. Hasta donde sabemos, estos datos proporcionan evidencia directa de que el PPE activa la señalización de ERK1 / 2 y AMPK en células epiteliales intestinales. Los efectos de estos inhibidores en las proteínas de unión estrecha todavía necesitan ser clarificados en el futuro, considerando que los inhibidores farmacológicos tales como los utilizados en el presente estudio pueden inhibir otras quinasas. Curiosamente, la inhibición de p38-MAPK mostró efectos contradictorios, ya que los valores de TER mostraron mayores aumentos. Estos resultados sugieren fuertemente que la activación de p38 MAPK tiene un papel negativo en la regulación de la permeabilidad de las células Caco-2. Hasta donde sabemos, estos datos proporcionan evidencia directa de que el PPE activa la señalización de ERK1 / 2 y AMPK en células epiteliales intestinales. Estos resultados sugieren fuertemente que la activación de p38 MAPK tiene un papel negativo en la regulación de la permeabilidad de las células Caco-2. Hasta donde sabemos, estos datos proporcionan evidencia directa de que el PPE activa la señalización de ERK1 / 2 y AMPK en células epiteliales intestinales. Estos resultados sugieren fuertemente que la activación de p38 MAPK tiene un papel negativo en la regulación de la permeabilidad de las células Caco-2. Hasta donde sabemos, estos datos proporcionan evidencia directa de que el PPE activa la señalización de ERK1 / 2 y AMPK en células epiteliales intestinales.
Debe observarse que la modulación mediada por PPE de la función de barrera no estaba relacionada con la citotoxicidad (como se demostró mediante el ensayo de viabilidad de células 8 del recuento de células. Algunos estudios han sugerido que los aumentos en TER podría ser generado por una disminución del número de células, ya que tanto la densidad celular y los espacios intracelulares en la monocapa aumento . En nuestro estudio, la inmunofluorescencia tinción de las células nos permitió demostrar que la expresión espacial de la occludin y ZO-1 proteínas tenían un patrón de unión similar en las células tratadas y también mostrar que la densidad celular también no fue afectada por el tratamiento. Por otra parte, utilizando la microscopía electrónica de transmisión, se mostró por primera vez que PPE-células tratadas tenían estructuras de tejido normal, a diferencia de las células de control de daño tBHP.
En nuestros estudios previos in vitro utilizando macrófagos murinos (Raw264.7) se encontró que la concentración de PPE hasta 10 μ g / mL fue eficaz, pero las concentraciones por encima de este fueron tóxicos para las células . En este estudio, la concentración más alta de propóleo aplicado a las células epiteliales intestinales humanas fue de 50 μg / mL, ya que esta dosis fue la más efectiva para aumentar la función de barrera intestinal. Dado que las muestras que utilizamos son las mismas en estos dos estudios, inferimos que las células epiteliales intestinales tienen mayor tolerancia a los EPP que los macrófagos. En nuestros estudios en animales anteriores, el propóleo se administró por sonda a una dosis de 100 mg / kg de peso corporal a las ratas / ratones. Esta dosis fue segura y eficaz contra la endotoxina inducida por el ratón lesión pulmonar aguda y aliviar lesión hepatorrenal en ratas diabéticas . La tasa de incorporación de propóleo en pienso (0,3% p / p ) fue diseñada para que las ratas alcanzaran una dosis aproximada de 100 mg / kg de peso corporal una vez que se tomaron en cuenta los niveles estimados de ingestión de alimento. Esta racionalidad de selección de dosis también nos proporciona una referencia para los futuros ensayos clínicos potenciales de propóleos.

Conclusiones
En general, el PPE mejoró la función de barrera en la monocapa de células Caco-2 y promovió la expresión de ARNm de occludina del colon en ratas alimentadas con dietas que contenían PPE. Además, los efectos del PPE sobre la regulación de la función de barrera intestinal fueron mediados, al menos en parte, por la activación de AMPK y ERK1 / 2, y se regularon negativamente mediante la señalización p38 MAPK. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos beneficiosos de los alimentos ricos en polifenoles (p. Ej., Propóleos de abeja) sobre la salud intestinal y tienen importantes implicaciones para la prevención / tratamiento de las EII humanas.